¿Cuál es la diferencia entre los ensayos de PCR anidados y en tiempo real convencionales?

El diferencia clave entre ensayos de PCR anidados y en tiempo real convencionales es que la PCR convencional es una técnica desarrollada para amplificar secuencias específicas de ADN y PCR anidada es una modificación de la PCR convencional que consta de dos reacciones de amplificación secuenciales, mientras que la PCR en tiempo real es una variante de PCR convencional que puede cuantificar el producto amplificado.

La PCR es una técnica científica muy común ampliamente utilizada en investigación y medicina para detectar el ADN. Las pruebas de PCR se utilizan para detectar antígenos detectando su ADN o ARN. En general, el ARN viral está presente en el cuerpo antes de detectar anticuerpos o mostrar los síntomas de la enfermedad. Una prueba de PCR puede decir si alguien tiene o no el virus desde el principio. Actualmente, la PCR es la prueba estándar para detectar la enfermedad de CoVID-19. Existen diferentes tipos de técnicas de PCR, como PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR multiplex, PCR de arranque en caliente y PCR de largo alcance, etc.

CONTENIDO

1. Descripción general y diferencia de claves
2. ¿Cuáles son los ensayos de PCR convencionales?
3. ¿Cuáles son los ensayos de PCR anidados?
4. ¿Qué son los ensayos de PCR en tiempo real?
5. Similitudes: ensayos de PCR anidados y en tiempo real convencionales
6. Ensayos de PCR convencionales vs anidados vs en tiempo real en forma tabular
7. Resumen: ensayos de PCR convencionales vs anidados vs en tiempo real

¿Cuáles son los ensayos de PCR convencionales??

El ensayo de PCR convencional es un in vitro Técnica de amplificación de ADN realizada rutinariamente en laboratorios biológicos moleculares. Este método permitió la producción de miles a millones de copias de un fragmento de ADN particular. Kary Mullis introdujo esta técnica en 1980. Esta técnica requiere un fragmento de ADN conocido como plantilla para hacer muchas copias de ella. Taq polimerasa funciona como la enzima ADN polimerasa y cataliza la síntesis de nuevos hilos de la secuencia de la plantilla.

Los cebadores en la mezcla de PCR funcionarán como puntos de partida para las extensiones de fragmentos. Todos los ingredientes que son necesarios para hacer copias de ADN se incluyen en la mezcla de PCR. La reacción de PCR se ejecuta en una máquina de PCR, y debe alimentarse con la mezcla de PCR correcta y el programa de PCR correcto. Si la mezcla de reacción y el programa son correctos, producirá el número requerido de copias de una sección particular de ADN de una cantidad muy pequeña de ADN.

Figura 01: Ensayo de PCR convencional

Hay tres pasos principales involucrados en una reacción de PCR: desnaturalización, recocido de cebadores y extensión de la cadena. Estos tres pasos ocurren a tres temperaturas diferentes. El tampón PCR mantiene las condiciones óptimas para la acción de la polimerasa Taq. Estas tres etapas de la reacción de PCR se repiten para producir la cantidad requerida del producto PCR. En cada reacción de PCR, el número de copias de ADN se duplica. Por lo tanto, la amplificación exponencial se puede observar en PCR. El producto de PCR se puede resolver utilizando electroforesis en gel, ya que produce una cantidad visible de ADN en un gel, y se puede purificar para estudios adicionales como la secuenciación.

La PCR es una herramienta valiosa en la investigación médica y biológica. Especialmente en estudios forenses, la PCR tiene un valor inmenso ya que puede amplificar el ADN para estudios de las pequeñas muestras de los delincuentes y hacer perfiles de ADN forense. La PCR se usa ampliamente en muchas áreas de biología molecular que incluyen genotipado, clonación de genes, detección de mutaciones, secuenciación de ADN, microarrays de ADN y pruebas de paternidad.

¿Cuáles son los ensayos de PCR anidados??

La PCR anidada es un tipo de PCR que reduce la amplificación no específica del ADN. Hay dos PCR sucesivas o dos reacciones de amplificación secuenciales en el ensayo de PCR anidado. Durante la primera reacción de amplificación, se produce un producto de PCR. Después de la primera reacción, se realiza una segunda reacción de amplificación en el producto de PCR de la primera reacción. Por lo tanto, los cebadores en la segunda mezcla de reacción se unen con el primer producto de PCR y lo amplifican.

Figura 02: PCR anidada

Los pares de cebadores son diferentes en cada reacción. La unión no específica de los cebadores se reduce en PCR anidada. Los ensayos de PCR anidados son útiles para aumentar la sensibilidad y/o la especificidad. Sin embargo, la PCR anidada requiere conocimiento sobre la secuencia interesada.

¿Qué son los ensayos de PCR en tiempo real??

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (Q PCR) es una versión modificada de PCR que mide los productos de PCR cuantitativamente. Por lo tanto, esta técnica cuantifica la amplificación en tiempo real utilizando una máquina de PCR en tiempo real. También es un método adecuado para determinar la cantidad de una secuencia o gen objetivo presente en una muestra.

La característica interesante de la PCR en tiempo real es que combina la amplificación y la cuantificación verdadera en un solo paso. Por lo tanto, la necesidad de electroforesis en gel para la detección puede ser eliminada por la técnica de PCR en tiempo real. El uso de tintes fluorescentes para etiquetar los productos de PCR durante las reacciones de PCR eventualmente conducirá a cuantificación directa. Cuando se acumulan los productos de PCR, las señales fluorescentes también se acumulan y serán medidas por la máquina en tiempo real. Sybr Green y Taqman son dos métodos para detectar o observar el proceso de amplificación de la PCR en tiempo real. Ambos métodos monitorean el progreso del proceso de amplificación e informan la cantidad del producto en tiempo real.

Figura 03: PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real tiene una amplia variedad de aplicaciones, como cuantificación de expresión génica, microARN y análisis de ARN no codificante, genotipado de SNP, detección de variantes de número de copias, detección de mutaciones raras, detección de organismos modificados genéticamente y detección de agentes infecciosos.

¿Cuáles son las similitudes entre los ensayos de PCR anidados y en tiempo real convencionales??

• Los ensayos de PCR anidados y en tiempo real son modificaciones del ensayo de PCR convencional.
• Las tres técnicas amplifican las muestras de ADN.
• Sus productos se pueden usar en secuenciación o análisis.
• Estos ensayos requieren cebadores.

¿Cuál es la diferencia entre los ensayos de PCR anidados y en tiempo real convencionales??

La PCR convencional es una técnica desarrollada para amplificar secuencias específicas de ADN. Mientras tanto, la PCR anidada es una modificación de la PCR convencional que consta de dos reacciones de amplificación secuenciales, y la PCR en tiempo real es una variante de PCR convencional que puede cuantificar el producto amplificado.  Entonces, esta es la diferencia clave entre los ensayos de PCR anidados y en tiempo real convencionales. A diferencia de la PCR convencional y en tiempo real, la PCR anidada utiliza dos conjuntos de cebadores. Además, hay dos reacciones de amplificación sucesivas en PCR anidada para reducir la amplificación no específica. Además, los ensayos de PCR convencionales y en tiempo real no contienen dos reacciones de amplificación secuenciales.

La siguiente infografía enumera las diferencias entre los ensayos de PCR anidados y en tiempo real convencionales en forma tabular para la comparación de lado a lado.

Resumen: ensayos de PCR convencionales vs anidados vs en tiempo real

La PCR convencional es la primera técnica desarrollada para amplificar fragmentos específicos de ADN. La PCR anidada y la PCR en tiempo real son dos variantes de PCR convencional. Hay dos reacciones de amplificación secuenciales y el uso de dos conjuntos de cebadores en PCR anidada. La PCR en tiempo real se desarrolla para cuantificar el producto de PCR amplificado. Por lo tanto, esto resume la diferencia entre los ensayos de PCR anidados y en tiempo real convencionales.

Referencia:

1. Verde Mr, Sambrook J. "Reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR)."Protocolos de Cold Spring Harbour, u.S. Biblioteca Nacional de Medicina.
2. "Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real."Una descripción general | Temas de ciencias.

Imagen de cortesía:

1. "Reacción en cadena de la polimerasa" por Enzoklop - Trabajo propio (CC BY -SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
2. "PCR anidada" de Zephyris en la Wikipedia en inglés (CC By-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
3. "REAL TIEMPO PCR" de İnformatic - trabajo propio (CC BY -SA 3.0) a través de Commons Wikimedia